了解健康和疾病中的细胞电通信需要精确的亚细胞电生理调节。纳米材料辅助的光热刺激被证明可以以高时空分辨率调节细胞活动。此类应用的理想候选者有望在近红外窗口具有高吸光度、高光热转换效率和直接放大生产以实现未来转化。在这里，我们展示了二维Ti3C2TX（MXene）作为具有高时空分辨率的神经元电活动的远程、非遗传、光学调制的杰出候选者。Ti3C2TX在单片水平上测量的光热响应导致635和808 nm激光脉冲（1 ms，10 mW）的局部温升分别为2.31 ± 0.03和3.30 ± 0.02 K。用Ti3C2TX薄膜(25 μg/cm2)或Ti3C2TX薄片分散体(100 μg/mL)孵育6天的背根神经节(DRG)神经元未显示对细胞活力的可检测影响，表明Ti3C2TX是无细胞毒性的。使用Ti3C2TX薄膜和薄片光热刺激DRG神经元，每脉冲入射能量低至数十微焦耳（635 nm，薄膜为2 μJ，薄片为18 μJ），具有亚细胞靶向分辨率。Ti3C2TX的直接和大规模合成允许在多个尺度上转换报告的光热刺激方法，从而提供了一种强大的工具，用于从单细胞到工程组织的增材制造调节电生理学。
卡耐基梅隆大学
关键词：
Ti3C2TX MXene
光学的
调制
神经元
背根神经节
研究复杂神经元功能的一个关键挑战是能够以高时空分辨率调节神经元活动。最先进的微电极阵列(MEA)可以高精度刺激细胞，但它们缺乏细胞类型特异性，需要侵入性植入，这会导致组织损伤。光遗传学是一项重大突破，它允许在体外和体内在没有植入生物电子学的情况下进行远程控制，但其对基因修饰以驱动光敏通道表达的要求限制了其临床可转化性。或者，用红外(IR)激光脉冲直接照射神经元的膜会导致膜去极化，从而在没有植入或遗传修饰的情况下产生动作电位。然而，IR刺激需要每个脉冲的高入射能量来调节细胞活动，这可能会损害目标细胞和组织。
纳米材料辅助光热刺激提供了一种远程、非遗传的方法来刺激具有亚细胞空间(μm)和亚毫秒时间分辨率的细胞和组织。最近，Au-（例如原始和功能化的Au纳米颗粒(AuNPs)和Au纳米棒(AuNRs)）、Si-（介孔Si颗粒、Si纳米线（SiNWs）和Au装饰的SiNWs）和C-（碳纳米管（CNTs)、石墨颗粒和纳米线模板化三维(3D)模糊石墨烯(NT-3DFG)）材料被证明是光热刺激的有希望的候选材料，不会产生细胞应力。然而，这些材料至少面临以下挑战之一：有限的近红外(NIR)吸收、低NIR光热转换效率和有限的生产可扩展性。
过渡金属碳化物/氮化物(MXenes)已成为一类新兴的二维(2D)纳米材料，其中过渡金属的原子层夹着二维碳或氮原子层。改变MXenes的原子设计使合成的纳米材料表现出优异的机械性能、高导电性、优异的电化学性能和可调的光学响应。因此，MXenes已在机器人、光子学、海水淡化和生物医学工程等广泛领域得到应用。Ti3C2TX由于其高近红外吸收、高光热转换效率和无细胞毒性在光热疗法（PTT）中引起了极大的关注。(19,21−23)在这里，我们证明Ti3C2TX是远程、非遗传、光热刺激神经元电活动的绝佳候选者，具有高时空分辨率。此外，Ti3C2TX的合成过程允许大规模生产以建立跨多个尺度的生物界面。基于Ti3C2TX的光热刺激将为理解复杂的神经元功能提供强大的工具集，并使基于光学的神经疾病治疗成为可能。
2D Ti3C2TX是一种近红外吸收剂
Ti3C2TX薄片是使用完善的协议（参见材料和方法）合成的，基于原子力显微镜(AFM)测量，产生尺寸为9.72 ± 1.84 μm2和厚度为2.12 ± 0.41 nm的二维薄片，这表明存在单层薄片（图1A和表S1）。Ti3C2TX薄片通过拉曼光谱得到证实（图1B），其中单个薄片的光谱呈现四个特征峰（图1B，红色箭头）。从光谱中可以收集到一些细节：147.4和200.3 cm-1处的峰分别归因于Ti原子的面内和面外伸缩振动，以及640.4和723.1 cm-1处的峰表示C原子的平面内和平面外伸缩振动（图1B和表S2）。Ti3C2TX薄片的表面终止以-O基团为主，如385.3 cm-1处的峰值所示（图1B，灰色区域）。其他终端包括-OH和-F基团，这是在含氟水溶液中蚀刻的结果（图1B）。
图1. Ti3C2TX的结构和光学特性。分散在平均厚度为1.16 ± 0.11 nm的Si/300 nm SiO2衬底上的单层Ti3C2TX薄片的代表性原子力显微镜(AFM)图像。插图：从点1到点2的厚度轮廓。比例尺为1 μm。分散的Ti3C2TX薄片的代表性拉曼光谱。红色箭头表示Ti3C2TX的内部振动模式，灰色区域表示表面终端TX的振动模式。不同浓度的Ti3C2TX悬浮液的平均vis-NIR吸收光谱（从下到上：10、20、30、40和50 μg/mL）（n = 3）。插图：不同浓度Ti3C2TX悬浮液的光学图像。比例尺为2厘米。吸光度与Ti3C2TX悬浮液浓度的函数关系，分别在635 nm（红色）和808 nm（黑色）。数据表示为平均值± SD (n = 3)。
二维Ti3C2TX薄片表现出表面等离子体(SP)共振，其中带间跃迁到官能团的空能状态导致NIR窗口中的吸收增强。在我们的Ti3C2TX悬浮液（图1C）中观察到了类似的光吸收特性，其中悬浮液在大约10处有一个吸收峰。由于局部表面等离子体共振(LSPR)效应（图1C），波长为785 nm。(30,32,33) 635和808 nm处的消光系数分别计算为19.2和21.8 L g–1 cm–1（图1D），这与公布的数据（25.2 L g–1 cm –1在808 nm）。与近红外活性吸收剂（如AuNRs）和附加吸收剂（如SiNWs或NT-3DFG）相比，由于带间过渡的一致性，Ti3C2TX中横向表面等离子体峰的位置不依赖于横向薄片尺寸，并且可以调整通过合成协议改变材料的表面化学。NIR窗口对于生物医学应用至关重要，特别是对于体内研究，因为由于水和血红蛋白的吸收相对较低，该窗口中的辐射在组织中具有更深的穿透深度。因此，Ti3C2TX成为NIR光热调制的有希望的候选者。
单片Ti3C2TX具有光热活性
Ti3C2TX具有很高的光热转换效率，已被用于PTT中，用于肿瘤消融和增强水分蒸发。然而，Ti3C2TX的光热性能仅在宏观尺度上使用悬浮液进行评估。(19, 22, 23)由于溶剂的干扰，此类测量不能代表单薄片水平的光热效应。在以亚细胞精度刺激细胞和组织之前，必须精确评估Ti3C2TX薄片的光热效应。在这里，我们使用基于微量移液器的技术（图2A，图S1）（参见材料和方法）表征了单个Ti3C2TX薄片的光热性能。
图2.单个Ti3C2TX薄片具有光热活性。基于微量移液管的温度测量技术的示意图，用于评估孤立的Ti3C2TX薄片的光热响应。孤立的Ti3C2TX薄片的光学图像，在薄片附近有一个玻璃微量移液管。比例尺为10 μm。在脉冲宽度为1 ms和不同入射激光功率的635 nm激光照射下，作为时间函数的孤立Ti3C2TX薄片（如图B所示）的平均温度变化。数据表示为10个单独脉冲的平均值。在脉冲宽度为1 ms的635 nm（红色）和808 nm（黑色）激光脉冲下，测量两个独立的代表性Ti3C2TX薄片的最大温度变化与入射激光功率的函数关系。数据表示为10个单独激光脉冲的平均值± SD。
Ti3C2TX的光热性能用635和808 nm激光器表征（图2和图S2）。对于具有代表性的孤立薄片（图2B），局部温度变化从0.68 ± 0.02增加到2.31 ± 0.03 K，入射激光功率分别从2增加到10 mW（635 nm激光，1 ms脉冲，约20 μm光斑尺寸）（图2C、图S2和表S3）。用NIR激光器（808 nm、10 mW、1 ms脉冲、约20 μm光斑尺寸）照射隔离的Ti3C2TX薄片导致局部温度变化为3.30 ± 0.02 K（图2D、图S2和表S4）。808 nm处更高的光热性能归因于Ti3C2TX在NIR窗口中的吸收增加。我们的结果表明，孤立的Ti3C2TX薄片引起局部温度类似升高所需的能量密度至少比AuNRs和AuNPs低1个数量级，比Si基材料（SiNWs和Au装饰）低2个数量级。SiNWs)，并与最近开发的C基材料(NT-3DFG)相媲美（表S7）。因此，Ti3C2TX是一种出色的单片级光热活性材料。
为了说明在电生理学的光热调制中实施Ti3C2TX的容易性，我们还评估了Ti3C2TX作为薄膜的光热响应。我们通过将已知浓度的Ti3C2TX悬浮液滴铸到玻璃盖玻片上来制备Ti3C2TX薄膜（图S3；参见材料和方法）。25 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜的俯视扫描电子显微镜(SEM)图像表现出紧凑的形态，截面SEM图像显示薄膜厚度为90 ± 35 nm（n = 3个样品，每个样品5个图像）样本，每幅图像3次测量）（图S3）。对于25 μg/cm2 Ti3C2TX上的代表性光斑，局部温度变化为10.66 ± 0.05 K，入射激光功率为10 mW（635 nm激光，1 ms脉冲，光斑尺寸约20 μm）。测得的温度变化约为。与单个Ti3C2TX薄片相比，高5倍，这归因于多个薄片的累积光热效应（图S4和表S5）。因此，光热活性的Ti3C2TX薄膜和薄片都可能允许以较低的入射能量对细胞活动进行光热调节。
Ti3C2TX薄片粘附在细胞膜上
细胞的光热刺激利用诱导细胞膜电容的瞬时变化。这需要光热活性剂紧邻质膜。我们研究了Ti3C2TX薄片与具有两种类型界面的背根神经节(DRG)神经元之间的相互作用：直接在Ti3C2TX薄膜上培养的DRG神经元和与分散的Ti3C2TX薄片孵育的DRG神经元。选择了25 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜，因为它具有高覆盖率和半透明特性，允许使用定制显微镜对DRG细胞进行透射光成像（图S5）。在生理条件下培养Ti3C2TX薄膜不会导致结构和表面终止的变化，这由培养前后的拉曼光谱和SEM图像证明。（图S6）。
培养的DRG神经元很好地粘附在Ti3C2TX膜上，没有任何分层（图3A和B）。Ti3C2TX膜仅在培养细胞下方观察到，在DRG神经元的细胞膜内未观察到Ti3C2TX薄片（图3A和B）。在DRG神经元上分散的Ti3C2TX薄片的情况下，薄片随机分布在整个细胞培养物中并粘附到细胞膜上，在24小时潜伏期后没有观察到任何内化（图3C、D和图S7）。Ti3C2TX薄片和DRG神经元之间的这种密切相互作用建立了一个有希望的界面，以实现有效的光热刺激。
图3. Ti3C2TX与DRG神经元的接口。Ti3C2TX薄膜和DRG神经元之间的界面。用质膜染色剂（红色，CellMask质膜染料）标记的DRG神经元的代表性3D重建共聚焦激光扫描荧光图像，接种在25 μg/cm2 Ti3C2TX膜（白色）上。白色箭头表示Ti3C2TX薄片。比例尺为10 μm。(II) I中单元格的正交部分。比例尺为10 μm。接种在Ti3C2TX薄膜上的DRG神经元的代表性SEM图像。比例尺为10 μm。(II) I中标记的红色虚线框的展开视图。比例尺为1 μm。分散的Ti3C2TX薄片和DRG神经元之间的界面。用质膜染色剂（红色，CellMask质膜染料）标记的DRG神经元的代表性3D重建共聚焦激光扫描荧光图像，与100 μg/mL Ti3C2TX薄片（白色）的分散体孵育24小时。白色箭头表示附着在神经元上的Ti3C2TX薄片。比例尺为10 μm。(II) I中单元格的正交部分。比例尺为10 μm。用100 μg/mL Ti3C2TX薄片孵育的DRG神经元的代表性SEM图像。白色箭头表示与神经元连接并分散在基底上的Ti3C2TX薄片。比例尺为10 μm。(II) I中标记的红色虚线框的展开视图。比例尺为1 μm。
在使用Ti3C2TX薄膜和薄片进行光热刺激之前，有必要评估它们的细胞毒性。为此，我们通过用Ti3C2TX薄膜（25 μg/cm2）和Ti3C2TX薄片（100 μg/mL）孵育DRG神经元长达6天来研究细胞毒性。对照样品、Ti3C2TX薄膜和分散的Ti3C2TX薄片的计算存活率分别为95.4 ± 3.4%、94.8 ± 3.2%和96.5 ± 2.2%（图4）。结果表明Ti3C2TX（作为薄膜或薄片）对神经元活力没有可检测的影响（图4）。
图4. Ti3C2TX薄膜和分散体对DRG神经元活力没有可检测的影响。在没有Ti3C2TX的情况下对DRG神经元进行活/死检测，(II)使用25 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜，和(III)使用100 μg/mL Ti3C2TX薄片分散体6天。绿色(Calcien AM)、红色(ethidium homodimer-1)和蓝色(Hoechst)分别表示活细胞、死细胞和细胞核。比例尺为100 μm。在没有Ti3C2TX（对照）、25 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜（薄膜）和100 μg/mL Ti3C2TX薄片分散体（分散体）上培养的DRG神经元的活力。数据表示为平均值± SD（每个条件n = 5道菜，每道菜10张图像）。国家标准表示无显着差异。星号表示p < 0.05的统计学显着差异（单向方差分析和事后Tukey）。
Ti3C2TX薄膜可对DRG网络进行光热刺激
为了证明Ti3C2TX膜的光热神经元调制能力，在Ti3C2TX膜上培养DRG神经元，并使用Ca2+成像评估刺激期间的神经元电活动（图5A和图S8）。Ca2+是一种普遍存在的二级信使，在可兴奋细胞的信号转导中起关键作用。因此，在动作电位期间监测细胞内Ca2+浓度的变化可作为研究细胞电活动的指标。为了评估光热刺激对Ca2+动力学的影响，DRG神经元用Ca2+指示剂CalBryte 520 AM标记（参见材料和方法）。在将单个1 ms、10 mW激光脉冲（635 nm，每脉冲10 μJ（约3.2 J/cm2））应用到DRG神经元-薄膜界面后，观察到Ca2+流入（图5B，电影S1）。激光靶向神经元的细胞内Ca2+瞬变（图5B，感兴趣区域1（ROI 1））表现出快速上升和缓慢衰减，这与报告的DRG神经元的Ca2+瞬变一致（图5C）。基于Ti3C2TX薄膜的DRG神经元光学调制具有高度可重复性（图S8、表S6和电影S2）。由于细胞-材料界面的局部温度变化很大，高能激光脉冲的光热刺激可能会导致细胞光毒性。因此，有必要通过优化入射激光脉冲的总能量来最小化安全光热刺激所需的局部温度变化。我们观察到在DRG-Ti3C2TX界面入射的低至2 μJ（约0.6 J/cm2）的激光能量可以成功刺激DRG神经元（表S6）。对目标DRG神经元的刺激导致相邻细胞中的Ca2+瞬变延迟（图5B和C、ROI 2-5和电影S1）。Ca2+波在网络中的传播归因于间隙连接的存在和细胞间激动剂的细胞外扩散。细胞之间的确切通信机制需要进一步研究。
图5. DRG电活动可以通过Ti3C2TX薄膜进行调节。示意图表示DRG神经元和Ti3C2TX膜之间界面处的光热刺激事件。与Ti3C2TX薄膜连接并用Ca2+指示剂(CalBryte 520 AM)标记的代表性DRG神经元的明场和时间序列荧光图像。在t = 5.6 s时施加10 mW功率和1 ms脉冲持续时间的635 nm激光脉冲。红色箭头表示激光目标点。白色圆圈表示用于荧光强度分析的ROI。比例尺为20 μm。归一化Ca2+荧光强度作为B中标记的ROI的时间函数。红色箭头表示应用激光脉冲的起点(t = 5.6 s)。
如前所述，使用基于Si、Au和C的材料进行光热刺激遵循光电容机制。(5,9,35,44)光电容机制表明靠近细胞膜的光诱导温度梯度(dT/dt)将导致膜电容的变化，随后产生瞬态电容电流，Ic。因此，将激光脉冲远离细胞膜界面将不会产生足够的Ic来引发动作电位。为了说明这一点，使用相同的激光脉冲条件在远离DRG神经元的点照射Ti3C2TX薄膜不会导致Ca2+荧光强度发生任何变化（图S9）。这证实了Ti3C2TX薄膜的光热刺激需要薄膜和目标DRG神经元之间的紧密界面。
DRG–Ti3C2TX薄片接口允许高分辨率神经元调制
为了在不使用Ti3C2TX涂覆整个基板的情况下实现具有亚细胞分辨率的光刺激，将分离的Ti3C2TX薄片与DRG神经元连接（图6A）。DRG神经元和Ti3C2TX薄片界面处的单个激光脉冲（635 nm、18 mW和1 ms脉冲，每个脉冲18 μJ（约5.7 J/cm2））导致诱发动作电位，如表观细胞内Ca2+瞬变（图6B和C、电影S3和表S6）。我们注意到，由于Ti3C2TX薄膜的薄片密度较高，分散薄片的每个脉冲刺激DRG神经元所需的能量高于薄膜，这导致局部温度变化更大（图S4和表S5）。将激光瞄准DRG神经元上的某个点而不是Ti3C2TX薄片上的点不会导致任何Ca2+瞬变（关闭Ti3C2TX，图S10）。此外，将激光瞄准远离DRG神经元的一点也不会导致任何Ca2+瞬变（细胞外，图S10）。这些结果表明分离的Ti3C2TX薄片允许具有亚细胞空间分辨率的有效光学调制。
图6.分散的Ti3C2TX薄片对DRG活性的光学调制。DRG神经元网络和分散的Ti3C2TX薄片界面示意图。用Ca2+指示剂(CalBryte 520 AM)标记的代表性DRG神经元的明场图像和时间序列荧光图像。在t = 5.0 s时施加18 mW功率和1 ms脉冲持续时间的635 nm激光脉冲。红色箭头表示激光目标点。白色圆圈表示用于荧光强度分析的ROI。比例尺为20 μm。归一化Ca2+荧光强度作为B中标记的ROI的时间函数。红色箭头表示应用激光脉冲的起点(t = 5.0 s)。
在这项工作中，我们证明了2D Ti3C2TX (MXene)可用于具有亚细胞分辨率的神经元电活动的远程和非遗传调制。我们测量了单片水平的Ti3C2TX光热性能，并观察到在635和808 nm脉冲（10 mW和1 ms）下的局部温度变化分别为2.31 ± 0.03和3.30 ± 0.02 K。与DRG神经元连接的Ti3C2TX薄片不会改变细胞活力，也不会内化；相反，它们紧密地粘附在细胞膜上。Ti3C2TX薄膜和薄片都能够对DRG神经元进行光热刺激，每个激光脉冲具有微焦耳级能量（薄膜为2 μJ（约0.6 J/cm2），薄片为18 μJ（约5.7 J/cm2））。使用Ti3C2TX进行光热刺激的有效能量密度至少比现有的Au和Si基光热剂低1个数量级，并且与C基材料(NT-3DFG)相当（表S8）。与光电活性p-i-n Si膜和SiNW相比，Ti3C2TX需要相似的入射能量密度来刺激神经元。除了低入射能量密度之外，Ti3C2TX还将允许在未来的生物医学工程应用和干预中转换所报告的光热刺激方法，并易于直接和大规模合成。此外，这种技术可以潜在地与电刺激相结合，并用于组织工程以构建实际治疗的原型。
材料和方法
Ti3C2TX的合成
Ti3C2TX合成遵循先前发布的协议。TiC（99.5%，~325目，Alfa Aesar，目录号40178-30）、Ti（99.5%，~325目，Alfa Aesar，目录号42624-22）和Al（99.5%，~325目，Alfa Aesar，目录号11067-30)将质量比为2:1:1的粉末与氧化锆球以2:1的氧化锆与粉末比率在球磨机中以70 rpm的速度混合18小时。将混合好的粉末放入氧化铝坩埚中，用石墨箔覆盖，放入管式炉中。在室温下用100 sccm Ar气流吹扫管式炉30分钟，然后以3°C/分钟的加热/冷却速率加热至1380°C 2小时。使用TiN涂层铣刀将Ti3AlC2块磨成Ti3AlC2粉末。然后将1克Ti3AlC2粉末与10 mL的9 M HCl（Fisher Scientific，目录号320331）缓慢混合，并在室温下搅拌4小时。混合物用5 μm滤膜真空过滤，残留粉末用去离子水洗涤，直到滤液的pH值约为6.洗涤后的Ti3AlC2粉末在真空烘箱中在80°C下干燥6小时，并通过450目（32 μm）颗粒筛筛分后收集。在60 mL高密度聚乙烯瓶中加入6 mL DI-H2O、12 mL 12 M HCl和2 mL 50 wt% HF（Acros Organics，目录号AC223330250）。将1 g的Ti3AlC2粉末加入到制备好的溶液中，并在35°C下以400 rpm的速度混合24小时。
将混合物在175 mL离心管中以3500 rpm离心5分钟，然后倾析并用DI-H2O重新分散沉淀物。重复这个过程，直到上清液的pH值达到约。6获得多层Ti3C2TX沉积物。将沉淀物分散到50 mL的0.5 M LiCl溶液（99.3% Chem-Impex Int.目录号30595）中，并在室温下以400 rpm的速度搅拌4小时。沉淀物用去离子水洗涤并以3500 rpm离心5分钟。倒出上清液，将沉淀物重新分散在DI-H2O中，并以3500 rpm的速度离心1小时。此步骤再重复3次。最后，将Ti3C2TX悬浮液以3500 rpm的速度离心20分钟，收集上清液。
原子力显微镜(AFM)
AFM是使用MultiMode 8-HR (Bruker)在攻丝模式下进行的。将0.5 mg/mL Ti3C2TX悬浮液以2000 rpm的速度旋涂在O2等离子体处理的Si/300 nm SiO2基板上，然后以5000 rpm的速度旋转15秒以干燥样品。Si尖端（Budget Sensors，美国，Tap300Al-G；f0 = 300 kHz，k = 40 N/m）用于表征样品。扫描速度为0.8 Hz。
拉曼光谱
使用NT-MDT光谱（NT-MDT光谱仪器）和532 nm激发激光，使用100×/0.7 NA物镜获得分离的Ti3C2TX薄片的拉曼光谱。为了制备样品，将20 μL 10 μg/mL Ti3C2TX悬浮液滴铸在涂有100 nm Au的Si/600 nm SiO2基材上。使用0.5中性密度滤光片和30秒采集时间采集光谱。通过物镜测得的激光功率为1.95 mW（配备S121C探测器的PM100D功率计，Thorlabs）。光谱是从3个独立样本的10个随机分布的点获得的。
可见-近红外(Vis-NIR)吸收光谱
Vis-NIR吸收光谱使用ASEQ LR1-T宽范围光谱仪（ASEQ Instruments）进行表征。从五种不同浓度的Ti3C2TX悬浮液（10、20、30、40和50 μg/mL）获得Vis-NIR吸收光谱。每个浓度测量三个独立光谱，结果表示为这三个独立测量的平均值。消光系数根据Beer-Lambert定律确定：其中A是吸光度，ε是消光系数，L是比色皿的长度（1厘米），c是Ti3C2TX悬浮液的浓度。使用MATLAB（MathWorks）进行线性曲线拟合以计算消光系数。
扫描电子显微镜(SEM)
使用FEI Quanta 600场发射枪SEM进行SEM成像。图像是在2-20 kV的加速电压和5 mm的工作距离下获得的。没有对任何用于SEM成像的样品施加额外的导电涂层。
Ti3C2TX薄膜制备
在0.9 cm × 0.9 cm显微镜盖玻璃（Fisher Scientific，目录号12-541A）上制备不同密度的Ti3C2TX薄膜。基板在丙酮中的超声波浴（Crest Ultrasonics，型号CP230D）中清洗5分钟，然后是异丙醇洗涤和N2吹干。表面涂有聚-L-赖氨酸（PLL）（Sigma-Aldrich，目录号P8920）。将不同浓度的Ti3C2TX悬浮液（50 μL）滴铸并在室温下风干，得到15、25、35、45和55 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜。
光热表征
使用先前描述的微量移液管技术和定制显微镜对分离的Ti3C2TX薄片进行光热表征。使用带有40×/0.80 NA水浸物镜（尼康）的定制显微镜传送635或808 nm激光（NaKu Technology）脉冲。使用晶体管-晶体管逻辑(TTL)信号控制激光脉冲的持续时间。在进行光热表征之前，使用光电二极管功率计（带有S121C检测器的PM100D，Thorlabs）在连续波操作下校准通过物镜的激光输出功率。
使用由WinWCP软件（开源）控制的膜片钳放大器（A-M Systems 2400型）进行电压钳测量。使用微量移液器拉拔器（P-97，Sutter Instruments）从外径为1.5 mm和内径为0.86 mm的玻璃毛细管（Sutter Instruments，目录号BF150-86-10）中拉出微量移液器，最终阻力约为1-2 MΩ在1×磷酸盐缓冲盐水(1× PBS)溶液（康宁，目录号21-040-CV）中。为了进行光热表征，将Ti3C2TX薄片分散在PLL改性的玻璃底皿（Matsunami，目录号D35-14-1.5-U）上。简而言之，将培养皿在UV-Ozoneat 25°C下处理10分钟，然后添加100 μL 0.02% (w/v) PLL 5分钟。吸出PLL溶液，用去离子水和N2吹干培养皿3次。将20微升10 μg/mL Ti3C2TX悬浮液滴铸在表面处理过的盘子上并在室温下风干。在光热表征过程中，培养皿中装有4 mL 1× PBS溶液，并将Ag/AgCl线放置在腔室中。使用数字温度计（Signstek，6802-II）连续测量溶液的温度。通过显微镜选择分离的Ti3C2TX薄片，并通过机械手控制玻璃微量移液管尖端从所选薄片获取约1-2 μm以记录局部温度变化。尖端位于薄片的边缘，以避免被移液管壁反射的光。通过微量移液器的电流和微量移液器的电阻以电压钳模式连续记录，保持电位Vp为75 mV。施加功率范围为2至10 mW的1毫秒激光脉冲。光热电流(ΔIthermal)可以使用以下等式表示： 其中ΔIthermal、R0、R和I0分别是光热电流、室温下的微管电阻、激光照射期间的微管电阻和暗态电流.为了将微量移液器的电阻校准为温度的函数，将4 mL的1× PBS溶液加热至约50 °C并加入培养皿中。热电偶放置在微量移液器的尖端附近以测量温度。为了建立校准曲线，记录微量移液器的电阻，直到达到25 °C的浴温（图S1）。微量移液器的电阻和温度之间的依赖性遵循阿伦尼乌斯定律：其中R、R0、A、T和C是测得的微量移液器电阻、室温微量移液器电阻、校准曲线斜率、温度和校准曲线截距， 分别。分别使用635和808 nm激光器对7和10个独立的Ti3C2TX薄片进行了光热表征。Ti3C2TX薄膜(25 μg/cm2)的光热表征是在635 nm激光照射下在两个代表性薄膜样品的10个随机选择的点上进行的。
背根神经节(DRG)细胞培养
从成年雄性Sprague-Dawley大鼠（Envigo）获得DRG神经元，并如前所述收获。在匹兹堡大学，体重在240至400克之间的大鼠以12:12的光：暗循环，随意进食和饮水。实验得到匹兹堡大学机构动物护理和使用委员会的批准，并遵循NIH实验室动物使用指南。在收获DRG神经元之前，用含有55 mg/kg氯胺酮（Henry Schein，目录号056344）、5.5 mg/kg甲苯噻嗪（Henry Schein，目录号033197）和1.1 mg的混合物对大鼠进行麻醉。/kg乙酰丙胺（Henry Schein，目录号003845）。随后用1×PBS灌注大鼠，收集DRG神经元，酶处理，并机械分离以制备细胞接种悬液。
然后将DRG神经元接种在未涂层和Ti3C2TX薄膜涂层的玻璃底培养皿上。简而言之，将培养皿在25°C下用紫外线臭氧处理10分钟，然后用70%乙醇（Pharmco-Aaper，目录号111000200）和紫外线照射1小时进行消毒。然后将培养皿用无菌DI-H2O冲洗3次，用300 μL 50 μg/mL聚D-赖氨酸(PDL)（Sigma-Aldrich，目录号P6407）在室温下处理1小时，冲洗3次用无菌DI-H2O，并在无菌条件下在细胞培养罩中干燥30分钟。将PDL包被的培养皿与250 μL的20 μg/mL层粘连蛋白（Corning，目录号354232）在37°C下用5% CO2孵育1小时，随后用无菌1× PBS冲洗3次。将DRG神经元接种在PDL-层粘连蛋白处理过的培养皿上，并在加入4 mL培养基之前在37°C下用5% CO2孵育3小时。培养基由Dulbecco改良Eagle培养基（Corning，目录号15-013-CM）+ 1% Glutamax（ThermoFisher，目录号35050-061）+ 1%青霉素/链霉素（ThermoFisher，目录号15140122）+ 10%胎牛血清（Invitrogen，目录号10082147）。DRG神经元在37°C下用5% CO2孵育24-48小时直至使用。
用Ti3C2TX连接DRG神经元
为了研究DRG-Ti3C2TX界面，将DRG神经元与Ti3C2TX薄膜和薄片连接起来。DRG-薄膜接口遵循上述样品制备方案。为了连接DRG神经元和分散的Ti3C2TX薄片，将Ti3C2TX悬浮液在紫外线照射下灭菌1小时，并以100 μg/mL的终浓度添加到DRG神经元培养物中。具有分散薄片的培养皿在37°C下与5% CO2孵育24小时。CellMask橙色质膜染色剂（ThermoFisher，目录号C10045）用于染色细胞膜。将细胞培养物与染料(5 μg/mL)在37°C和5% CO2下孵育15分钟。Tyrode缓冲溶液（Sigma，目录号T2145），pH值约为7.4补充有1 g/L NaHCO3（Sigma，目录号S576），持续用含有5% CO2和95% O2（Airgas）的碳气灌注20分钟。样品用碳化的Tyrode溶液轻轻洗涤3次。DRG神经元和Ti3C2TX界面使用具有微分干涉对比(DIC)的z-stack活细胞成像和具有40×/0.80 NA水浸物镜的扫描激光共聚焦荧光成像进行成像。使用Imaris 3/4D图像可视化和分析软件(Oxford Instruments)生成3D重建和正交截面。
然后使用4%多聚甲醛（电子显微镜科学，目录号15710）在1×PBS中的溶液在室温下在平板振荡器上固定20分钟。样品用1×PBS冲洗3次，然后用DI-H2O冲洗3次。DI-H2O连续替换为100%乙醇（25%、50%、75%、90%和100%）。在每次交换期间，样品在室温下孵育10分钟。将100%乙醇与六甲基二硅氮烷(HMDS)（Sigma-Aldrich，目录号440191）（50%和100%）连续交换，并在每次交换期间在室温下孵育20分钟。然后吸出HMDS，并将样品在室温下在干净的通风橱中干燥。固定和干燥的样品使用SEM成像，没有任何额外的表面涂层，加速电压和工作距离分别为2 kV和5 mm。
活力测定
对接种在玻璃底培养皿（对照）上、接种在25 μg/cm2 Ti3C2TX薄膜（薄膜）上的DRG神经元进行活力分析，并与100 μg/mL的Ti3C2TX薄片（分散体）一起孵育。按照上述样品制备方案制备样品。对于所有样品，DRG神经元的接种密度为4500个细胞/培养皿。为了维持神经元表型，培养基中添加了10 nM/mL 2.5S NGF（Sigma-Aldrich，目录号01-125）。为了最大限度地减少神经胶质细胞的增殖，将有丝分裂抑制剂尿苷（Sigma-Aldrich，目录号3750）和脱氧尿苷（Sigma-Aldrich，目录号D5412）以40 μM的终浓度添加到培养基中。在进行活力测定之前，将样品在37 °C和5% CO2下培养6天。对于该测定，样品用活/死测定试剂盒（ThermoFisher，目录号L3224）标记。活细胞用2 μM钙黄绿素乙酰氧基甲基(Calcein AM)标记；死细胞用4 μM乙锭homodimer-1 (EthD-1)标记；并且用1 μM Hoechst 33342（ThermoFisher，目录号62249）标记细胞核。加入染料后，将样品在37 °C和5% CO2下孵育15分钟。然后用温热的碳化Tyrode溶液洗涤样品3次。使用直立共聚焦显微镜和20×/0.50 NA水浸物镜（尼康）进行DIC和扫描激光共聚焦荧光成像。对每个条件5个培养皿和每个培养皿10个图像进行活力量化。生存力计算为
光热刺激的Ca2+成像
为了在光热刺激期间对神经元进行Ca2+成像，通过将样品与5 μM CalBryte-520（AAT Bioquest，目录号20650）在37℃下孵育60分钟，与Ti3C2TX薄膜和分散的Ti3C2TX薄片结合的DRG神经元用Ca2+指示剂染料标记°C，然后在室温下在黑暗中放置30分钟。然后将样品用碳化的Tyrode溶液洗涤3次，并装载到定制显微镜的载物台上。在光热刺激实验期间，通过样品保持22 °C的新鲜碳化Tyrode溶液的连续流动。
使用白色LED（6 W LED双鹅颈式照明器，AMScope，产品编号：LED-6W）进行明场照明，而使用473 nm激光（UltraLasers，产品编号CST-L-）进行荧光成像473-50-OEM)和绿色荧光蛋白(GFP)过滤器（Thorlabs，目录号MF525-39）。使用单色互补金属氧化物半导体相机（Basler acA3088-57 μm，Basler）使用Pylon Viewer (Basler)获取Ca2+荧光和明场图像。在激光照射之前获取明场图像，在激光照射期间以每秒五帧的速度获取Ca2+荧光图像序列。来自635 nm激光器的激光脉冲由TTL信号控制，并通过40×/0.80 NA水浸物镜施加在薄片-细胞界面上。ImageJ（基于Java的开源图像处理软件，NIH）和MATLAB用于荧光强度分析。数据表示为(F – F0)/F0vs时间，其中F0是应用激光脉冲前前五秒的平均强度，F是时间相关的荧光强度。分别在13个和3个DRG神经元网络上对薄膜和分散的片状细胞界面进行光热刺激。
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